Genetické pozadie CDKL5

Ako fungujú gény?

Aby sme pochopili ako mutácie spôsobujú stavy ako CDKL5, treba vedieť ako gény pracujú. Gény sú v našej DNA. Gén je ako „plán na výkrese“. Je to v podstate návod na tvorbu proteínu a skladá sa z reťazca báz alebo bázových párov. V DNA sú použité 4 bázy, adenín, cytozín, guanín a tymín. Často sa nazývajú bázové páry, pretože DNA je tvorená dvoma vláknami, v ktorých sú bázy spojené do párov– adenín vždy tvorí pár s tymínom a guanín tvorí pár s cytozínom. To bol jeden z kľúčových objavov, ktorý viedol k objaveniu štruktúry DNA v roku 1953 (objavili ju Crick a Watson). 

Obr. č. 1 - Bunka→Jadro bunky→Chromozóm→DNA

Obr. č. 2 - Od DNA k proteínu

Gén je špecifická časť DNA, ktorá je kódom pre tvorbu bielkoviny (proteínu). Proteín pozostáva z reťazca aminokyselín a každé 3 bázové páry, nazývané kodón, sú kódom pre 1 aminokyselinu (aminokyselina je základná stavebná jednotka bielkoviny). Kód sa konvertuje do proteínu prostredníctvom RNA. Ak gén je „plán“, potom RNA je „šablóna“, ktorá sa kopíruje z génu a použije sa na tvorbu proteínu. 

Šablóna RNA sa odvodí z DNA prostredníctvom procesu, ktorý sa nazýva transkripcia (prepis). Štruktúra, ktorá sa volá ribozóm (niečo ako továreň na proteíny), si potom prečíta šablónu RNA a použije ju na vytvorenie reťazca aminokyselín pomocou procesu, ktorý sa nazýva translácia (preklad) – a pozrime sa! už máme proteín!

Tak, ako je veta vytvorená zo slov a medzier medzi slovami, tak gén je vytvorený z exónov (slov) a intrónov (medzier). Keď sa genetický kód číta a premieňa na proteín, intróny sa odstránia a exóny sa pospájajú, aby vytvorili genetický kód, ktorý sa nakoniec prečíta a dáva vznik proteínu.

Zaujímavé je, že medzery medzi slovami (intrónmi) sú v skutočnosti oveľa dlhšie ako samotné slová (exóny).
A               tak              gén                  môže                vyzerať                asi                 takto.
Navyše, intróny môžu obsahovať dôležité informácie o tom, ako sa gén bude čítať a premieňať na proteín. 

Obr. č. 3 - Štruktúra génu

Obr. č. 4 - Ľudský genóm

Gén CDKL5

Gén CDKL5 je zložený z 24 exónov, vrátane exónu 16b, ktorý sa nachádza medzi exónom 16 a exónom 17. Na začiatku génu sa nachádzajú exóny 1, 1a a 1b, ktoré, zdá sa, neprispievajú priamo k štruktúre proteínu, keďže nepodliehajú procesu translácie (prekladu genetického kódu do štruktúry proteínu). 

Do štruktúry proteínu sa tak premieňa kód z 21 exónov (exóny 2 až 21 – vrátane exónu 16b), Tento proteín môže existovať minimálne v 4 rôznych formách. To závisí od toho, koľkými exónmi je kódovaný, pričom počet exónov, ktoré sú prekladané do štruktúry proteínu môže byť 18 až 21.

Exóny 2 až 11 majú kód pre kinázovú doménu proteínu a i keď sa v literatúre objavujú určité dôkazy o tom, že mutácie v tejto časti génu by mohli mať za následok závažnejší priebeh ochorenia oproti mutáciám v C-terminálnej doméne, situácia zďaleka ešte nie je jasná. Sú aj ďalšie mechanizmy, tzv. epigenetické faktory, ktoré môžu zohrávať úlohu pri závažnosti prejavov ochorenia.

Gény a mutácie – čo je príčinou CDKL5 poruchy?

Poradie bázových párov je mimoriadne dôležité pre tvorbu proteínu. Mutácia môže narušiť poradie bázových párov, a tak sekvencia aminokyselín nie je správna. V dôsledku toho sa proteín nevytvorí správne a ani nebude fungovať tak, ako by mal. Počiatočné štúdie dievčat s CDKL5 identifikovali mutácie definované ako vymazanie (deléciu) jednej bázy (báza je ako jedno písmeno vo vete, ktorá je génovým kódom) a chromozómové translokácie (iné usporiadanie písmen, resp. celých slov). 

Napríklad:
„Dlhá ale úzka cesta“  - vymazanie a spôsobí, že všetko sa posunie (tzv. frameshift) a vznikne Dlhá leú zka cesta!"  
V príklade „V kníhkupectve kupujemeknihy a v železiarstve kupujeme klince“  -  translokácia spôsobí, že dostaneme „V kníhkupectve kupujemeklince a v železiarstve kupujeme knihy“.

V obidvoch prípadoch mutácia zmenila usporiadanie génu alebo vety, takže zamýšľaný zmysel alebo funkcia sa stráca.

Bežné mutácie v CDKL5 sú aj substitúcie. „Pláva kačka po jazere“ sa môže zmeniť na „Pláva mačka po jazere“  
Tento problém sa nazýva aj mutácia so zmenou zmyslu a znovu preto, že sa zmenila štruktúra génu.

Posunové mutácie (frameshifts) a „Stop“ kodóny

Ako sme videli v príklade „Dlhá ale úzka cesta“, keď mutácia spôsobí vymazanie bázových párov, potom sa posunú všetky nasledujúce bázy – to sa nazýva posun čítacieho rámu (frameshift). To isté sa stane, keď sa vsunie nová báza do hotovej vety, do ktorej nepatrí. Posun bázových párov spôsobí posun trojíc kodónov, na základe ktorých sa vytvoria iné aminokyseliny a  sekvencia aminokyselín nevytvorí správny proteín so zachovanou funkciou. 

Obr. č. 5 - Znázornenie ako mutácia v géne spôsobí posun čítacieho rámu (frameshift)

„Stop" kodón je kodón, ktorý znamená, že sa dosiahol koniec proteínu – logicky sa nachádza obvykle na konci sekvencie bázových párov, ktorá kóduje proteín. Existujú 3 stop kodóny  - TAA, TAG a TGA. Keď dôjde k posunu čítacieho rámu (posunovej mutácii), vymazanie alebo vloženie môže vytvoriť nový kodón, ktorý bude „Stop“ kodón. To sa môže stať kdekoľvek v géne po mutácii a spôsobí to predčasné ukončenie tvorby proteínu, čo má za následok skrátenie (truncated) proteínu.

Aj pri substitúcii jedného nukleotidu môže vzniknúť stop kodón. Takáto mutácia sa nazýva ako nezmyselná mutácia, alebo mutácia typu „nonsense“.  Iné typy mutácií nájdete popísané tu.

Ako sa mutácie zapisujú v genetických správach

Gén CDKL5 má 21 exónov pozostávajúcich z 3092 bázových párov. Tie kódujú 1030 aminokyselín. Mutácie sa spravidla zapisujú použitím 2 hlavných druhov zápisov. Ako sme videli vyššie, mutácia v bázovom páre spôsobí zmenu v príslušnej aminokyseline a práve táto zmena má vplyv na štruktúru a funkciu proteínu CDKL5. V lekárskej správe, ktorú dostanete sa teda uvádza, ktorá báza je postihnutá – v takom prípade popis mutácie začína s „c.“ – alebo ktorá aminokyselina sa následne zmenila – to za označuje s „p.“.

Napríklad c.175C>T znamená, že báza cytozín na pozícii 175 (čo je exón 5) bol nahradený tymínom. To je substitúcia. Ďalší príklad by bol c.2047delG, čo je delécia (vymazanie) bázy guanínu na pozícii 2047 (v exóne 14). Ďalší typ mutácie je vloženie. Takže c.865insA znamená, že báza adenín bola včlenená (inzercia) do génu CDKL5 v pozícii 865, čo je exón 11. Všimnite si, že postihnutý exón vo formáte nie je zahrnutý.

Ak sa v správe hovorí o konzekvenčnej zmene aminokyseliny, vidíme niečo ako p.Ala40Val, čo znamená, že aminokyselina alanín bola nahradená aminokyselinou valín v pozícii 40 proteínového reťazca. Písmená sa používajú aj na označenie aminokyselín, takže tá istá mutácia môže byť zapísaná ako p.A40V. Táto zmena aminokyseliny z alanínu na valín sa udeje preto, že došlo k bázovej substitúcii na pozícii 119 v exóne 4 – čo sa zapíše ako c.119C>T. V správe môžete nájsť použitý len jeden formát alebo aj obidva formáty.

Skrátený, predčasne ukončený (truncated) proteín – v dôsledku mutácie typu nonsense alebo delécie (vymazania báz, príp bázy) alebo inzercie (včlenenia bázy), ktorá vytvorila predčasný stop kodón – sa obvykle označuje "X" alebo * ako napr. v p.R59X (p.R59*), čo bolo spôsobené vyššie uvedenou substitúciou c.175C>T, ktorá je preto tiež mutáciou typu nonsense. 

Obr. č. 6 - Skratky pre amínokyseliny

Ako vznikajú mutácie?

Zjednodušene povedané sú dva spôsoby ako môžu vzniknúť mutácie. Buď sú nadobudnuté alebo zdedené.

Nadobudnuté mutácie
K týmto mutáciám dochádza, keď sa genetický materiál v určitom momente poškodí, obvykle počas bunkového cyklu, kde sa DNA kopíruje ešte pred delením buniek. Mutácie „de novo“ sú tie, ku ktorým dôjde po prvý raz a u rodičov postihnutého dieťaťa nie sú prítomné. Predpokladá sa, že väčšina mutácií CDKL5 vzniká týmto spôsobom. V minulosti sa uvádzalo, že výskyt genetických porúch „de novo“ sa zvyšuje s narastajúcim vekom matky, teraz existujú určité dôkazy, že vek otca môže byť relevantnejší pre vznik určitých genetických ochorení.

Zdedené mutácie
Ochorenia viazané na autozómy (chromozómy číslo 1-22) sa dedia dominantne (mutácia n a1 kópii génu) alebo recesívne (mutácia na obidvoch kópiách génu). V prípade ochorení viazaných na gény na pohlavnom chromozóme X (k nim patrí aj CDKL5) je situácia iná. Môžu sa dediť dominantne (opäť stačí mutácia na 1 kópii génu), alebo recesívne (potrebné sú mutácie na obidvoch kópiách génu). Avšak do úvahy pripadá ešte jeden spôsob dedičnosti a tým je germinálny (zárodočný) mozaicizmus.

Čo je mozaicizmus?

Bunky, z ktorých sa skladá ľudské telo sa dajú zhruba rozdeliť na dva druhy. Zárodočné (germinálne) bunky, čo sú u mužov spermie a u žien vajíčka, zatiaľ čo somatické bunky zahŕňajú všetky ostatné bunky (ktoré tvoria svaly, kosti, kožu, mozog atď.). Mozaicizmus nastáva vtedy, keď osoba má 2 populácie buniek, a každá z nich má svoju odlišnú genetickú informáciu. Jedna populácia teda obsahuje „normálny“ genetický materiál, zatiaľ čo tá druhá populácia môže mať mutáciu alebo inú genetickú abnormalitu. Mozaicizmus môže postihnúť zárodočné aj somatické bunky. 

Zárodočný mozaicizmus
Pri zárodočnom mozaicizme je genetická abnormalita viazaná len na určitý podiel zárodočných buniek, pričom ostatné sú normálne. V tejto situácii jedinec nebude mať  žiadne príznaky ochorenia, keďže somatické bunky, ktoré vytvárajú zostávajúce časti tela, majú normálny genetický materiál. Jednotlivec napriek tomu môže mutáciu odovzdať ďalej prostredníctvom jednej z abnormálnych zárodočných buniek. Predpokladá sa, že to je jednou z mála príčin poruchy.

Somatický mozaicizmus
Pri somatickom mozaicizme sú zárodočné bunky ako aj väčšina telových buniek jedinca „normálne“, zdravé a len malá populácia telových buniek obsahuje mutáciu, genetickú zmenu. Takýmto mechanizmom vznikajú napríklad niektoré nádory, kedy sa z jednej bunky v dôsledku porušenej DNA vyvinie tumor, pričom však v ostatných bunkách tela je DNA normálna. Somatický mozaicizmus sa vyskytuje pri mnohých ďalších ochoreniach. Pri somatickom mozaicizme sa ochorenie neprenáša na potomstvo, keďže všetky zárodočné bunky sú normálne. Ale v ojedinelých prípadoch jedinec môže mať somatický aj zárodočný mozaicizmus a v takom prípade sa genetická abnormalita môže odovzdať potomstvu.

Obr. č. 7 - Chromozómový mozaicizmus

Hypoteticky, mimoriadne zriedkavo by bolo možné, aby matka mala mutáciu CDKL5, ale s extrémne nesúmerným (skewed) vzorcom inaktivácie chromozómu X (pozri nižšie), takže mutácia by bola sotva vyjadrená klinickými príznakmi. Matka môže byť relatívne nepostihnutá, ale v skutočnosti bude „nositeľkou“ mutácie CDKL5. Tento mechanizmus dedenia bude veľmi zriedkavý (nevieme zatiaľ o žiadnom takomto prípade a určite nie v súvislosti s CDKL5).

Inaktivácia chromozómu X

Gén CDKL5 sa nachádza na chromozóme X. Ženy majú dva chromozómy X (po jednom od každého rodiča), len jeden z nich je potrebný na normálne fungovanie a v skutočnosti by bolo škodlivé, ak by obidva chromozómy boli aktívne zároveň. Preto sa jeden z chromozómov X za normálnych okolností „vypne“ prostredníctvom procesu, ktorý sa nazýva inaktivácia chromozómu X.

Mutácia CDKL5 je obvykle prítomná len na jednom z chromozómov X, takže ak sa vypne chromozóm X s mutáciou, vtedy jedinec môže mať mutáciu, ale bez akéhokoľvek vplyvu, pretože ten chromozóm X, ktorý zostal aktívny, má normálny gén CDKL5. Ale nemusí to nevyhnutne byť ten istý chromozóm X, ktorý sa inaktivuje v každej bunke tela. 

Ukázalo sa, že telo môže mať skupiny buniek, v ktorých je neaktívny jeden chromozóm X a iné bunky, kde je neaktívny ten druhý chromozóm X. A tak v mozgu môžu byť oblasti, kde bunky používajú chromozóm X s mutáciou a iné oblasti, kde bunky používajú chromozóm X s normálnym génom CDKL5. 

Zdá sa, že to, ktorý konkrétny chromozóm X sa inaktivuje, je otázka náhody a „šance“. Je logické, že čím väčší podiel buniek používa chromozóm X s mutáciou, tým závažnejší môže byť fenotyp (prejavy ochorenia). Zostáva však úlohou potvrdiť, že stupeň inaktivácie chromozómu X skutočne má vplyv na závažnosť fenotypu. A tak vzťah medzi mutáciou a závažnosťou poruchy CDKL5 ostáva zatiaľ nejasný. 

Obr. č. 7 - Chromozóm X (jeden od otca, jeden od mamy)

Obr. č. 8 - Výsledky výskumu ohľadne schopnosti detí chodiť vo vzťahu      s miestom mutácie

V roku 2011 bol publikovaný zaujímavý prehľad z Francúzska, kde boli sumarizované klinické detaily 77 predtým publikovaných prípadov CDKL5. Medzi nimi je uvedených 51 osôb s najlepšími motorickými zručnosťami, z ktorých 21 je schopných kráčať na rôznej úrovni.

Keď sa skúmala schopnosť kráčať vo vzťahu s miestom mutácie, podľa toho ktorý exón je postihnutý, zistila sa určitá súvislosť. 

Analýza dát ukázala, že len 30% osôb s mutáciou, ktorá postihla exóny 1 až 11 je schopných do nejakej miery kráčať, ale toto percento sa zvyšuje na 61% u osôb, ktoré majú mutáciu postihujúcu exóny 12 až 21.

Zjavne to je len hrubá analýza, ktorá neberie do úvahy iné faktory ako typ mutácie, stupeň inaktivácie chromozómu X a zapojenie multi-exónov alebo intrónov.

Relevantné môžu byť aj iné klinické faktory napr. koľko a akých terapií jednotlivec absolvuje alebo či sú prítomné aj ortopedické faktory napr. problém s bedrami alebo chrbticou. Navyše, niektoré relatívne mladé deti sa môžu naučiť chodiť, zatiaľ čo iné, ktoré vedeli chodiť, môžu túto schopnosť stratiť, možno kvôli nedostatočnému zvládaniu epilepsie. Navyše, počet prípadov v tejto štúdii je relatívne malý. Preto v snahe získať odpovede na tieto otázky, nedávno bola vytvorená nová databáza s medzinárodným registrom poruchy CDKL5. Čím viac informácií o deťoch s poruchou CDKL5 sa bude do databázy zaznamenávať, dúfame, že tým viac odpovedí sa podarí nájsť na mnohé ďalšie otázky.

Čo je proteín CDKL5 a čo robí?

Obr. č. 9 - Proteín CDKL5

CDKL5 je skratka odvodená od Cyclin-Dependant Kinase-Like 5. Kináza je proteín, ktorý „energizuje“ iné proteíny aby konali. V tele máme približne 500 rôznych kináz. Jedna konkrétna skupina kináz sa aktivizuje, len keď sú napojené na ďalší proteín, ktorý sa volá cyklín. Preto sa nazývajú  cyklín-dependentné (t.j. „cyklín-závislé“) kinázy (CDK) a plnia dôležité úlohy v „bunkovom cykle“, kedy sa jediná rodičovská bunka delí na 2 dcérske bunky. Gén CDKL5 má kód pre proteín, ktorý sa správa „ako“ cyklín-dependentná kináza a existuje 5 známych proteínov CDKL. CDKL1-4 sa tiež nejakým spôsobom zúčastňujú na vývine mozgu.

Gén CDKL5 sa kopíruje, aby sa vytvoril reťazec aminokyselín, ktoré tvoria proteín CDKL5. Biochemické faktory a sily spôsobujú, že proteínový reťazec sa skrúti do 3-D štruktúry. Proteín CDKL5 sa delí na dve oblasti, na katalytickú alebo kinázovú doménu (podjednotku/časť) a koncovú - C-terminálnu doménu.

Kinázová doména je hlavná funkčná časť proteínu, ale z najnovších štúdií je jasné, že aj C-terminálna doména hrá významnú úlohu pri regulácii fungovania proteínu CDKL5.

Presná úloha proteínu CDKL5 ešte nie je známa, ale plní dôležitú úlohu vo vývine mozgu a tiež úzko súvisí s funkciu proteínu MECP2 spojeného s Rettovým syndrómom. Okrem toho sa zdá, že proteín CDKL5 môže byť mimoriadne dôležitý pre vývin mozgu od veku prvých niekoľkých týždňov života, keďže štúdie ukazujú, že v určitých oblastiach mozgu sa jeho prítomnosť zvyšuje.

Záleží na tom, ktorú časť génu CDKL5 mutácia postihne?

Obr. č. 10 - Proteín kináza prirovnaná ku kľúču

To ešte nevieme! Funkcia proteínu závisí od jeho 3-D štruktúry a tá je zasa závislá od  správnej sekvencie aminokyselín. Proteín kinázu si môžeme predstaviť ako kľúč s funkčnou časťou, kde zárezy sú urobené tak, aby zapadli do zámku a hlava je časť, ktorú držíte (na obr. Bow). Ak sa hlava odlomí, kľúč možno bude fungovať, ale nie až tak dobre. Ale ak nie sú v poriadku zárezy (na obr. Cuts) alebo kľúč sa zlomil hneď pri ramene (na obr. Shoulder), potom kľúč asi nebude vôbec fungovať.

Mutácia v géne CDKL5 môže mať podobný efekt, to znamená že postihuje tú časť proteínu, kde sú „zárezy“ (kinázová doména), a to môže mať väčšie následky ako keď je postihnutá len „hlava“ proteínu (v C-terminálnej doméne). Treba ešte preskúmať, či existuje alebo neexistuje taký vzťah. 

 

 

Autor: Dr. Martyn Newey

Zdroj: www.supporting-cdkl5.co.uk

Korekcia: MUDr. Gabriela Nagyová